Purificación de isoformas de proteasas tipo tripsina de crustáceos
Palabras clave:
Cromatografía, Crustáceos, Isoenzimas, Isoformas, Purificación, TripsinaResumen
Las tripsinas son las principales peptidasas digestivas de crustáceos. En los últimos años se han producido revisiones sobre las tripsinas de invertebrados, así como de crustáceos, e incluso de las presentes en determinada especie de crustáceo. Sin embargo, los aspectos relacionados con la purificación de estas enzimas (y sus isoformas) no se han abordado en estas revisiones. En la presente revisión se exponen los procedimientos más empleados en la purificación de tripsinas de crustáceos, las dificultades en la separación de isoformas, y se discuten las experiencias de los autores en la purificación de isoformas de tripsina en la langosta espinosa Panulirus argus, las cuales pudieran ser de interés para los que se inicien en el campo de la purificación de enzimas tipo tripsina de crustáceos. Se excluyen los aspectos básicos relacionados con los principios de cada método y con la purificación de proteínas en general, los cuales pueden ser encontrados en la vasta literatura publicada tanto en revisiones como en libros especializados.
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Los estudios realizados en nuestro laboratorio con el fin de separar las isoformas de tripsina en la langosta P. argus mostraron que el intercambio iónico puede ser una herramienta muy útil en la separación de estas enzimas. No obstante, las condiciones cromatográficas deben ser cuidadosamente establecidas en dependencia del efecto deseado en la separación. El pH tiene un efecto importante en la resolución; a pesar que la mayor parte de los estudios que emplean este método en crustáceos utilizan pH 7-8, la resolución empleando
intercambio aniónico en la separación de las tripsinas de la langosta mejora significativamente a pH 5.5 y más aún a pH 5. Contar con un estimado del punto isoeléctrico de las proteínas de interés es muy conveniente para seleccionar el pH de la fase móvil. No obstante, la estabilidad de las enzimas a estos valores tan bajos de pH es un aspecto que requiere una evaluación preliminar. En la experiencia de los autores, a veces es imprescindible trabajar a pH bajos y tolerar cierta pérdida de rendimiento debido a la precipitación isoeléctrica, a
la desnaturalización irreversible, o a ambas, en vistas a lograr separar la mayor cantidad de isoformas.
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